这一页讲的是「怎么把看不见的微生物养出来、挑出来、数出来」。核心是三件事:配培养基(给微生物吃喝住)、做无菌操作(不让杂菌捣乱)、会接种与计数(把菌分开、数明白)。灭菌和消毒不是一回事,选择培养基和鉴别培养基也不是一回事——这两组概念是这一章的命门。
培养基是人工配制的、供微生物生长繁殖(或积累代谢产物)的营养基质。不管配方多花哨,五大类成分缺一不可(特殊营养物质除外):
| 成分 | 作用 | 常见来源 |
|---|---|---|
| 碳源 | 提供碳架和能量 | 糖类(如葡萄糖)、CO₂(自养菌) |
| 氮源 | 合成蛋白质、核酸 | 硝酸盐、铵盐、尿素、蛋白胨、N₂(固氮菌) |
| 水 | 溶剂,参与代谢 | 蒸馏水 |
| 无机盐 | 维持渗透压、pH,组成酶活性中心 | 各种矿质元素盐 |
| 特殊营养物质 | 某些菌自己不能合成、必须外供 | 维生素、氨基酸、血液等 |
配好后必须调节到适宜的pH(不同微生物最适 pH 不同,如细菌偏中性偏碱、霉菌偏酸性),再灭菌备用。
固体培养基(加琼脂等凝固剂,如琼脂培养基)——用于分离、计数、观察菌落形态。液体培养基(不加凝固剂)——用于大量扩大培养、发酵生产。
选择培养基与鉴别培养基(见下节详解)。
⚠ 培养基里"糖类"是碳源,不是能源的全部说法——对异养菌,碳源常常同时是能源;对自养菌(如硝化细菌),碳源是CO₂,能源另有其他(如氧化氨)。别把碳源等同于能源。
四个开关分别代表碳源、氮源、水、无机盐是否加入配方。全部勾选→微生物茁壮生长;去掉任意一类→生长受阻或停滞。特殊营养物质因菌而异,这里不作为必需项。
选择培养基利用微生物营养需求或抗性的差异,人为造出「有的活得下、有的活不下」的环境,从而把目标菌从混合菌群中富集出来。
| 目标 | 怎么设计培养基 | 原理 |
|---|---|---|
| 筛选固氮菌 | 培养基中不加任何氮源(缺氮培养基) | 只有能自身固定N₂的菌才能生长,其他菌因缺氮死亡/不长 |
| 筛选分解尿素的细菌 | 以尿素为唯一氮源 | 只有能分泌脲酶分解尿素、获得氮的菌才能生长 |
| 筛选抗某抗生素的菌 | 培养基中加入该抗生素 | 敏感菌被抑制/杀死,抗性菌照常繁殖 |
| 筛选纤维素分解菌 | 以纤维素为唯一碳源 | 只有能分泌纤维素酶的菌才能利用碳源生长 |
⚠ 选择培养基的关键词是「唯一」「缺」「加入抑制剂」——凡是把营养做成「卡脖子」条件,就是选择培养基思路;它筛掉的是「长不出来的」,不是靠变色区分。
圆点代表混合菌群:蓝=普通敏感菌,绿=抗性菌/固氮菌。切换培养基类型,看哪些点存活(实心)、哪些死亡(变灰淡出)。
鉴别培养基不筛掉其他微生物,而是加入某种指示剂或化学试剂,利用目标菌特有的代谢反应,使菌落或培养基变色,从而把目标菌从一堆菌落里"认出来"。
| 鉴别培养基 | 加入的指示剂/试剂 | 目标菌与现象 |
|---|---|---|
| 伊红美蓝(EMB)培养基 | 伊红 + 美蓝 | 大肠杆菌大量分解糖产酸,与两种染料结合,菌落呈黑色并带金属光泽 |
| 尿素培养基 | 尿素 + 酚红指示剂 | 分解尿素的细菌产生脲酶,尿素分解出氨使环境变碱性,酚红遇碱变红 |
| 刚果红培养基 | 刚果红染料(与纤维素结合显红) | 纤维素分解菌分泌纤维素酶分解周围纤维素,菌落周围出现透明圈(脱色圈) |
选择 + 鉴别可以叠加: 比如筛选纤维素分解菌时,常用「以纤维素为唯一碳源(选择)+ 刚果红染色(鉴别透明圈大小判断分解能力强弱)」的组合培养基。
⚠ 鉴别培养基的关键词是「指示剂」「变色」「透明圈」——它不负责把别的菌饿死,只负责让你一眼认出目标菌;选择培养基关键词是「唯一」「缺」「抑制剂」。两者常被出题人混在一起考,看关键词区分。
点击不同培养基类型再点「培养」,观察目标菌落的显色/透明圈变化。这是"看现象倒推菌的代谢能力"的经典考法。
灭菌: 使用强烈的理化因素杀灭物体内外一切微生物,包括芽孢和孢子。用于培养基、接种工具等要求绝对无菌的场合。消毒: 只杀死物体表面或内部部分微生物(主要是不产生芽孢的病原微生物),达不到彻底无菌。
| 方法 | 属于 | 典型对象 | 能否杀灭芽孢 |
|---|---|---|---|
| 灼烧灭菌 | 灭菌 | 接种环、接种针 | 能(直接烧成灰) |
| 干热灭菌 | 灭菌 | 玻璃器皿、金属器械 | 能 |
| 高压蒸汽灭菌 | 灭菌 | 培养基、无菌水、耐高温耗材 | 能 |
| 煮沸消毒 | 消毒 | 某些用具 | 不能(芽孢耐煮沸) |
| 巴氏消毒 | 消毒 | 牛奶等饮品(60~70℃左右) | 不能 |
| 化学药剂消毒(如75%酒精) | 消毒 | 皮肤、操作台 | 不能 |
| 紫外线消毒 | 消毒 | 接种室、无菌室空气 | 不能(仅体表/空气) |
实验室怎么用: 接种环、接种针——每次用前用前用后都要在酒精灯火焰上灼烧灭菌,待冷却后再蘸取菌种(灼热的环会直接烫死菌种,必须先冷却);培养基、锥形瓶、吸管等——用高压蒸汽灭菌锅灭菌(通常121℃、15~20分钟);双手、操作台面——用酒精棉球擦拭消毒即可,不必也无法灭菌。
⚠ 最常见失分点:把"灭菌"和"消毒"当同义词混用,或以为煮沸/酒精也能杀灭芽孢。牢记—— 芽孢是灭菌与消毒的分水岭:能杀灭芽孢才叫灭菌。
柱高≈处理强度(温度/能量),芽孢图标变灰=被杀灭、保持黑色=存活。只有灼烧和高压蒸汽能把芽孢也杀光。
用灼烧灭菌并冷却后的接种环蘸取少量菌种,在无菌平板培养基表面连续划线:每划完一线,再灼烧接种环冷却后,从上一次划线的末端开始划下一线(角度错开),如此重复5~7次。原理:每一次新划线,接种环上的菌数被前一线"稀释"、抹薄一次,划到最后菌液已经很稀,单个细胞之间彼此分开,培养后各自长成分离的单菌落。
先将菌液做梯度稀释(如10倍、100倍……),取一定体积(如0.1mL)的稀释液,用无菌涂布器均匀涂布在平板培养基表面,培养后长出分散的菌落。稀释倍数合适时,菌落彼此分开、可以计数。
| 平板划线法 | 稀释涂布平板法 | |
|---|---|---|
| 工具 | 接种环 | 涂布器 + 移液管(稀释) |
| 目的 | 分离纯化菌种 | 分离纯化 + 可用于计数 |
| 能否计数 | 不能(划线不定量) | 能(取样体积、稀释倍数已知) |
⚠ 平板划线法每次划线前都要重新灼烧接种环并冷却——忘记灼烧,菌液浓度不会被稀释,划到最后仍是一片菌苔,长不出单菌落。
每次划完一个区域,接种环会重新灼烧(闪光提示),菌液浓度对半"稀释"。划到第5~6区时点密度已足够稀,可分离出单个菌落。
具体做法:把菌液作梯度稀释(如稀释10⁴、10⁵、10⁶倍),各取相同体积(如0.1mL)涂布到平板上,培养后选菌落数在30~300之间的平板计数(太多太少都不准),再按公式换算回原液浓度。通常同一稀释度做3个重复平板取平均值,减小误差。
稀释涂布平板法统计的是"菌落数",而不是直接数细胞个数。若两个或多个细菌细胞连在一起(没有被完全分散开),培养后它们只会长成一个菌落。于是统计出的菌落数往往比活菌的真实个数偏低——这是稀释涂布平板法计数活菌数的系统性偏差,而不是操作失误。
与显微镜直接计数(如血细胞计数板)对比: 显微镜计数法数的是"细胞总数"(含死菌),不能反映活菌比例;稀释涂布平板法数的是"能繁殖出菌落的活菌数",更能反映活菌情况,但会因细胞粘连而偏小。
⚠ 常见坑:①稀释倍数与菌落数换算搞反(应除以稀释倍数是把"稀释后的浓度"换算回"稀释前",不是乘);②选取的平板菌落数太少(<30)或太多(>300)都不能用于计数,前者随机误差大,后者菌落连成一片无法分辨;③把"计数偏小"的原因答成"操作污染"——标准答案是"两个或多个细胞连在一起只形成一个菌落"。
原液真实浓度固定为 2×10⁷ 个/mL(模拟设定)。拖动稀释倍数,看平板上菌落点从"多到连片"变到"稀疏可数",再变到"太稀太少"。只有落在30~300颗之间的稀释度才适合用来计数反推。
这是选择题、简答题都爱考的一个点,单独拿出来强化。当两个或多个活菌细胞在液体中挨得很近、涂布时没有被完全分散(如菌体成对、成链或成簇存在),它们会一起被涂布到平板同一位置,培养后只长出一个菌落(因为一个菌落本质是"一个可见的细胞堆"能不能分辨"里面曾经有几个细胞"是分辨不出来的)。所以:
⚠ 反过来"计数结果偏大"这种说法在人教版语境下是不合理的——偏小是稀释涂布平板法固有的系统误差方向,别写反。
左侧显微视野里有单个细胞、也有挨在一起的"细胞团"。点击培养,单个细胞各自长成一个菌落,而每一团挨在一起的细胞只长成一个菌落——这就是计数偏小的根源。
触发信号:给出培养基配方或缺某成分,问"还缺什么""能否正常培养""该成分作用是什么"。
标准动作:核对碳源/氮源/水/无机盐/(特殊营养物质)是否齐全;判断该微生物是自养还是异养(决定碳源来源);确认pH是否调节到适宜范围。
示例(带解):某培养基只含葡萄糖、水、无机盐,缺氮源。培养固氮菌可以正常生长(固氮菌能利用空气中N₂),但培养大肠杆菌则不能正常繁殖(大肠杆菌不能固氮,必须外源供氮)。
陷阱:把"碳源"等同于"能源";忽视pH调节这一步;误以为特殊营养物质对所有微生物都必需。
触发信号:"从土壤中分离出能分解某物质的细菌""筛选抗某药物的菌株""富集固氮菌"。
标准动作:把目标菌"独有的代谢能力"设计成培养基里"唯一"或"缺失"的条件(唯一碳源/唯一氮源/加入抑制剂),使非目标菌无法生长,目标菌照常生长。
示例(带解):要分离能分解尿素的细菌,应配制以尿素为唯一氮源的培养基;不能分解尿素的细菌因缺氮无法繁殖,能分解尿素的细菌正常生长,从而被富集分离出来。
陷阱:把选择培养基设计成加了指示剂但不限制营养(那是鉴别培养基思路);忘记选择培养基仍需具备水、pH等基本条件。
触发信号:"菌落变黑""菌落周围出现透明圈""培养基变红",问这说明什么、加了什么指示剂。
标准动作:先看现象对应哪种指示剂反应(EMB→黑色带金属光泽=大肠杆菌;尿素+酚红→变红=分解尿素产氨使碱性增强;刚果红→透明圈=纤维素被分解脱色)。
示例(带解):在刚果红培养基上某菌落周围出现明显透明圈,说明该菌能分泌纤维素酶分解刚果红染料结合的纤维素,是纤维素分解菌;透明圈越大,分解能力越强。
陷阱:把鉴别培养基当成选择培养基,以为不变色的菌就"死了"(实际上只是没有目标代谢能力,依然可能存活生长)。
触发信号:给出接种环、培养基、双手、牛奶、接种室空气等对象,问该用哪种灭菌/消毒方式。
标准动作:先问"要不要彻底杀灭芽孢/绝对无菌"——是→灭菌(灼烧/干热/高压蒸汽);否,只需降低微生物数量、保留营养或活性——消毒(煮沸/巴氏/酒精/紫外线)。
示例(带解):培养基必须绝对无菌,用高压蒸汽灭菌;接种环每次使用前后用灼烧灭菌;双手和操作台用70%~75%酒精消毒即可,不必灭菌(也做不到)。
陷阱:以为煮沸能灭菌(不能杀芽孢);以为紫外线能彻底灭菌(只消毒空气/表面,穿透力弱);混用"灭菌""消毒"两词。
触发信号:给出划线示意图或操作步骤,问"为什么每次划线前要灼烧接种环""为什么最后能得到单菌落"。
标准动作:抓住"接种环灼烧冷却→蘸菌→连续划线→稀释"这条链条;强调每次新划线都从上一线末端开始,菌液经多次划线被逐步稀释,最终分散为单个细胞。
示例(带解):某同学划线时忘记在第3次划线前灼烧接种环,结果第3、4区域菌落连成一片。原因:接种环上菌液没有减少(没被稀释),延续了前一区的高浓度,无法分离出单菌落。
陷阱:以为划线的目的是"消毒平板"(其实平板本身已灭菌,划线是为了稀释分离);忘记灼烧后要冷却再蘸菌(否则高温烫死菌种)。
触发信号:给出稀释倍数、涂布体积、平板菌落数,求原液浓度;或问"为什么计数结果比实际活菌数少"。
标准动作:公式 原液浓度(个/mL)= 平均菌落数 ÷ 涂布体积(mL) ÷ 稀释倍数;先检查所选平板菌落数是否落在30~300之间;偏小原因固定答案——两个或多个细胞连在一起只长成一个菌落。
示例(带解):取10⁻⁵稀释液0.1mL涂布,平板上长出150个菌落。原液浓度=150÷0.1÷10⁻⁵=1.5×10⁸个/mL。若该值仍比理论值偏低,原因是部分细胞成团存在,只形成了一个菌落。
陷阱:除法方向搞反(误乘稀释倍数);选了菌落数超过300或低于30的平板计数;把偏小原因答成"培养基灭菌不彻底"等无关因素。
① 灭菌 ≠ 消毒:灭菌要连芽孢一起杀死(灼烧、干热、高压蒸汽);消毒只杀部分微生物(煮沸、巴氏、酒精、紫外线),芽孢杀不死。
② 培养基必须用高压蒸汽灭菌,不能只用消毒方式处理,否则杂菌(尤其芽孢)会污染培养。
③ 接种环使用前后都要灼烧灭菌,灼烧后必须冷却才能蘸取菌种,否则高温杀死目标菌。
④ 选择培养基 ≠ 鉴别培养基:选择培养基靠"唯一营养/抑制剂"筛掉非目标菌;鉴别培养基靠"指示剂变色"认出目标菌,不筛掉别的菌。
⑤ 平板划线法不能用于计数(涂布量不定量);只有稀释涂布平板法可以计数。
⑥ 稀释涂布平板法计数结果总是偏小,原因固定:两个或多个细胞连在一起只形成一个菌落。不要答成操作污染或其他。
⑦ 选取计数用的平板,菌落数必须在30~300之间,过多过少都不准确,通常要设置重复组取平均值。
⑧ 原液浓度换算是"除以稀释倍数、除以涂布体积",别写成乘稀释倍数。
⑨ 尿素培养基变红的指示剂是酚红(遇碱变红),不是石蕊或其他指示剂;EMB培养基鉴别的是大肠杆菌,菌落呈黑色并带金属光泽。
⑩ 巴氏消毒和紫外线消毒都不能用于要求绝对无菌的培养基或器械灭菌,只适用于对温度/化学处理敏感、只需降低菌量的场合。
① 一切培养基设计都是"投微生物所好、卡它所需": 选择培养基的本质不是"毒死"目标外的菌,而是让它们"缺了活不下去的东西"(唯一氮源/唯一碳源)或"遇上了扛不住的东西"(抗生素)。理解这一点,任何"筛选XX菌"的新题,你都能自己设计培养基,而不用死记案例。
② 鉴别培养基的核心是"把代谢差异翻译成颜色差异": EMB黑色、酚红变红、刚果红褪色,本质都是"目标代谢产物 + 指示剂 → 可见变化"。抓住这条翻译链,遇到没见过的指示剂组合,也能推理出原理(先问:目标菌代谢会产生什么物质?这种物质会让指示剂怎么变?)。
③ 灭菌/消毒的选择是"成本-无菌需求"的权衡: 越怕污染(培养基、发酵罐)就要上强度最大的高压蒸汽灭菌;越怕破坏对象本身(牛奶怕高温变质、双手怕灼烧)就退而求其次用消毒。做题时先判断"这个对象经不经得起灭菌",答案往往就出来了。
④ 平板划线与稀释涂布,本质都是"用空间稀释代替试管稀释": 划线法在同一块平板上、靠反复灼烧完成稀释;涂布法在试管里预先梯度稀释、再摊开摊薄。两者共同目的都是让细胞在空间上充分分散,单个细胞才能长成肉眼可辨的单菌落——这是"看到一个菌落=一个祖先细胞"这一计数假设成立的前提。
⑤ 计数偏小是"以菌落数代替细胞数"这一方法本身带来的系统误差: 只要还在用"数菌落"这个手段,就永远无法排除"细胞粘连"的可能,所以稀释涂布平板法测得的活菌数是一个下限估计。真正想知道细胞总数(不分死活),要换用血细胞计数板等直接计数法;想要更接近真实活菌数,则要尽量提高稀释倍数、加强振荡分散,减小细胞粘连概率。
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